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돼지 복제 수정란 생산을 위한 골수 유래 줄기세포의 이용

Production of Porcine Embryos Cloned with Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells,

김해봉 (Jin Hai-Feng, 수의학과)

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  • 발행기관 경상대학교 대학원
  • 지도교수 노규진
  • 발행년도 2006
  • 학위수여년월 2006. 2
  • 학위명 석사
  • 소속대학원 및 학과 대학원 수의학과
  • 전공 수의산과학전공
  • 원문페이지 16, 77
  • 본문언어 영어
초록/요약moremore
Recent experimental evidence indicates that adult stem cells are more desirable than somatic cells for nuclear transfer (NT) because of their easy reprogrammability to resemble the genome of the zygote. Mesenchymal stem cells (MSCs) are a heterogeneous population of uncommitted and lineage-committed...
Recent experimental evidence indicates that adult stem cells are more desirable than somatic cells for nuclear transfer (NT) because of their easy reprogrammability to resemble the genome of the zygote. Mesenchymal stem cells (MSCs) are a heterogeneous population of uncommitted and lineage-committed cells and may have a more flexible potential as donor cells for NT. The aims of this study were 1) to characterize an isolated population of porcine MSCs from bone marrow, 2) to compare the developmental potential of cloned embryos with MSCs and porcine fetal fibroblasts (pFFs) by assessing the cleavage and blastocyst rate, total cell numbers, inner cell mass (ICM) ratio and apoptosis with in vitro produced (IVP) embryos, and 3) to analyze the expression profiles of some selected genes involved in the development of the pre-implantation embryos of in vivo- and NT-derived origin using MSCs and pFFs as donors. MSCs were obtained from the aspirated bone marrow of 6-8 month old pigs. Cells were centrifuged, resuspended, and plated in advanced-DMEM (ADMEM) supplemented with 5% fetal bovine serum (FBS). The differentiation potential was demonstrated by culture of MSCs (passage 3) under conditions that were favorable for adipogenic, osteogenic, and chondrogenic development. Oil red O staining revealed that MSCs produced lipid droplets after incubation in adipogenic media. Following osteo-induction, MSCs exhibited robust alkaline phosphatase activity and cells later transformed into mineralized nodules as demonstrated by von Kossa staining. Staining of proteoglycan indicated chondrogenic differentiation. Cumulus-oocyte complexes collected from a slaughterhouse ovaries were matured, fertilized, and cultured. Matured metaphase II oocytes for 44 h were used for experiment. Cleavage rate was significantly (P<0.05) higher in IVF embryos than in NT embryos derived from MSCs and pFFs (84.5±4.6% vs. 52.2±5.4% and 50.8±5.2%, respectively). However, blastocyst rates in in vitro fertilized (IVF) embryos and NT embryos derived from MSCs (20.6±2.5% and 18.5±3.0%) did not differ but these rates were significantly (P<0.05) higher than that for in NT embryos derived from pFFs (9.5±2.1%). Total cell numbers and the relative ratios of ICM to total cells of MSCs NT embryos (34.4±5.2 and 0.38±0.08, respectively) were significantly (P<0.05) higher than those of pFFs NT embryos (22.6±5.5% and 0.18±0.12, respectively). Proportions of TUNEL-positive cells in pFFs NT embryos (12.8±2.5%) were significantly (P<0.05) higher than those in MSCs NT embryos (8.6±1.8%) and in IVF embryos (4.6±1.5%). The expression profiles of genes involved in transcription and pluripotency (Oct4, Stat3, Nanog), pro-apoptosis (Bax), and anti-apoptosis (Bcl2l1) were determined. Total RNA was extracted from pools (triplicates) of 10 embryos each of 8-cell, morula, and blastocyst stages of in vivo and NT origin and carried out reverse transcription for real-time PCR. The mRNA of H2a was employed to normalize the levels as housekeeping gene. Significant differences (P<0.05) in the relative abundance of Stat3, Nanog, Bax and Bcl2l1 were observed in pFFs NT embryos compared with in vivo produced embryos, whereas embryos derived from MSCs showed expression patterns similar to those of in vivo produced embryos. However, Oct4 revealed similar expression profiles in NT- and in vivo-produced embryos. These results indicate that MSCs NT embryos had enhanced embryonic development and their gene expression pattern more closely resembled that of in vivo produced embryos. In addition, the results clearly demonstrate that multipotent bone marrow MSCs can make a suitable alternative to fibroblasts which have been commonly used as donor cells and have a greater potential for producing viable cloned porcine embryos.
초록/요약moremore
최근 연구결과에 따르면 핵이식의 성공효율을 상승시키기 위해서는 줄기세포가 체세포보다 그 재구성 능력면에서 더 바람직하다고 할 수 있다. 간엽줄기세포(MSCs)는 중립과 분화(lineage)가 정해진 군들이 섞여있으며 핵이식을 위한 공여세포로서 보다 적응성 있는 잠재력을 가졌다고 할 수 있다. 본 실험의 목적은 1) 돼지 골수에서 분리된 간엽줄기세포의 특성을 기술하였고, 2) 간엽줄기세포와 돼지 태아 섬유아세포를 이용한 복제란의 발달 잠재력을 비교하고자 체외수정란과 함께 초기 분할율, 배반포기 발달율, 총세포수, 내부세포괴 비율, ...
최근 연구결과에 따르면 핵이식의 성공효율을 상승시키기 위해서는 줄기세포가 체세포보다 그 재구성 능력면에서 더 바람직하다고 할 수 있다. 간엽줄기세포(MSCs)는 중립과 분화(lineage)가 정해진 군들이 섞여있으며 핵이식을 위한 공여세포로서 보다 적응성 있는 잠재력을 가졌다고 할 수 있다. 본 실험의 목적은 1) 돼지 골수에서 분리된 간엽줄기세포의 특성을 기술하였고, 2) 간엽줄기세포와 돼지 태아 섬유아세포를 이용한 복제란의 발달 잠재력을 비교하고자 체외수정란과 함께 초기 분할율, 배반포기 발달율, 총세포수, 내부세포괴 비율, 그리고 세포자가사멸을 조사하였고, 3) 간엽줄기세포와 돼지 태아 섬유아세포 (pFFs)를 이용한 복제란과 체내수정란을 이용하여 초기배아발달에 관련되는 유전자를 비교분석 하였다. 간엽줄기세포는 6-8개월령의 돼지 골수로부터 채취하였고, 채취된 세포는 원심분리와 재부양 과정을 거친 후 5% 소 태아 혈청(FBS)가 첨가된 advanced-DMEM (ADMEM)에서 배양되었다. 지원성(adipogenic), 골원성(osteogenic), 연골원성(chondrogenic) 세포로 분화시킴으로써 간엽줄기세포로 인정하였다. Oil red O 염색으로 확인한 결과 지원성 배양액에서 배양 후 간엽줄기세포에서 지방방울이 형성되었고, 골원성 유도 후에는 강한 alkaline phosphatases activity를 나타냈고, 그 이후 von Kossa염색방법으로 작은 결절형태로 변화하는 것을 관찰 할 수 있었다. 연골원성분화는 proteoglycan의 염색으로 관찰 할 수 있었다. 도축장유래 난자를 체외성숙, 수정 및 배양 하였고, 44 시간 체외성숙 시킨 제2감수분열중기(MII) 단계의 난자를 실험에 공시하였다. 체외수정란이 MSCs와 pFFs를 이용한 복제한에 비해 초기 분할율에서 유의적(P<0.05)으로 (84.5±4.6% vs. 52.2±5.4%, 50.8±5.2%). 그러나, 배반포기율에 있어서는 MSCs를 이용한 복제란이 체외수정란과 유의적 차이(20.6±2.5% and 18.5±3.0%) 를 보이지 않았으나, pFFs (9.5±2.1%)를 이용한 복제란은 유의적(P<0.05)으로 낮은 배반포 발달율을 보였다. MSCs를 이용한 복제 배반포란 (각각 34.4±5.2 and 0.38±0.08)의 총세포수와 내부세포괴 비율이 pFFs를 이용한 복제 배반포란(각각 22.6±5.5% and 0.18±0.12)에 비해 유의적(P<0.05)으로 높게 나타났다. pFFs를 이용한 복제란(12.8±2.5%) 에서의 TUNEL양성세포비율이 MSCs를 이용한 복제란 (8.6±1.8%)과 체외수정란(4.6±1.5%)에 비해 유의적(P<0.05)으로 높게 나타났다. 전사와 다능성(Oct4, Stat3, Nanog), 세포자가사멸 관련 (Bax, Bcl2l1) 유전자를 각각 비교 조사하였으며, 전체 RNA는 각각 8세포기, 상실배기, 배반포기 10개의 체외수정란과 복제란을 각각 따로 섞어서 추출하였고, 역전사 PCR를 실시하였다. H2a의 mRNA를 PCR를 위한 내부 기준으로 적용하였고, pFFs를 이용한 복제란에 있어서 상대적인 Stat3, Nanog, Bax, Bcl2l1의 양이 유의적으로 체외수정란에 비해 낮았으나, MSCs를 이용한 복제란의 경우는 체외수정란과 유의적인 차이를 보이지 않았다. 하지만, Oct4는 복제수정란(MSCs, pFFs)과 체내수정란에서 유사하게 나타났다. 이상의 결과에서 간엽줄기세포 (MSCs)를 이용한 복제수정란이 높은 배 발달율을 보였고, 또한 체내 수정란와 유사한 유전자발현양상을 보였다. 이상의 결과에서 다능성 골수 간엽줄기세포가, 근래 주로 복제수정란 생산을 위해서 사용되어지는 섬유아세포의 대안 공핵이 될 수 있을 것이고, 생존 가능한 돼지 복제 수정란 생산을 위한 보다 높은 잠재력을 가졌다고 할 수 있다.
목차moremore
ABSTRACT IN KOREAN =Ⅴ
HISTORY = 1
References = 7
...
ABSTRACT IN KOREAN =Ⅴ
HISTORY = 1
References = 7
ABSTRACT = 14
INTRODUCTION = 17
MATERIALS AND METHODS = 20
Preparation of Donor Cells = 20
In Vitro Differentiation of Mesenchymal Stem Cells = 21
Cytochemical Staining = 22
Oocyte Collection and In Vitro Maturation = 23
In Vitro Fertilization = 24
Nuclear Transfer = 24
In Vitro Culture = 25
Cytological Analysis = 26
Collection of In Vivo Embryos = 28
Gene Expression by RTPCR Analysis = 28
Experimental Design = 30
Statistical Analysis = 30
RESULTS = 32
In Vitro Differentiation of Osteocytes, Adipocytes and Chondrocytes from MSCs = 32
Comparison of the Developmental Potential of Embryos Cloned with pFFs and MSCs = 35
Comparison of Gene Expression Pattern in Embryos Cloned with pFFs and MSCs to In Vivo Embryos = 40
DISCUSSION = 47
REFERENCES = 61
APPENDIX = 74