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Structural Multiplicity of Arabidopsis Thioredoxin h3 Confers a Functional Diversity on the Protein

애기장대 티오레독신 h3 의 구조적 다양성에 따른 단백질의 기능 변화,

박수권 (Park, Soo-Kwon, 경상대학교 대학원)

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  • 발행기관 경상대학교 대학원 분자생물학과
  • 지도교수 이상열
  • 발행년도 2006
  • 학위수여년월 2006. 2
  • 학위명 박사
  • 소속대학원 및 학과 대학원 분자생물학과
  • 전공 분자생물학전공
  • 원문페이지 x, 96
  • 본문언어 영어
초록/요약moremore
본 연구에서는 식물세포의 열저항성 단백질들을 분리하기 위해서 모델 식물인 아라비돕시스 (Arbidopsis) 현탁배양세포 (suspension cell)로부터 단백질을 추출하고 90℃, 10 분 동안 열을 가한 후 상층액을 2-차원 SDS-PAGE와 MALDI-TOF을 통하여 다양한 열저항성 단백질들을 규명하였다. 이렇게 분리된 단백질 중의 하나인 티오레독신 h3-type (AtTrx-h3)는 13 kDa의 분자량을 가지고 있으며 생체 내에서 다른 이성질체들 (Trx-m, f, y, o, x)과 함께 주된 산화 환원 조절 기능을 가...
본 연구에서는 식물세포의 열저항성 단백질들을 분리하기 위해서 모델 식물인 아라비돕시스 (Arbidopsis) 현탁배양세포 (suspension cell)로부터 단백질을 추출하고 90℃, 10 분 동안 열을 가한 후 상층액을 2-차원 SDS-PAGE와 MALDI-TOF을 통하여 다양한 열저항성 단백질들을 규명하였다. 이렇게 분리된 단백질 중의 하나인 티오레독신 h3-type (AtTrx-h3)는 13 kDa의 분자량을 가지고 있으며 생체 내에서 다른 이성질체들 (Trx-m, f, y, o, x)과 함께 주된 산화 환원 조절 기능을 가지고 있는 것으로 알려져 있으나, 아직까지 그 생리학적인 역할이 명확하게 밝혀지지 않았다. AtTrx-h3의 생리학적인 활성과 역할 규명을 위해 아라비돕시스 cDNA library로부터 PCR 기법을 통해 유전자를 분리하여 대장균에서 과 발현 시켜 단백질을 순수 분리한 후, 인슐린 환원 분석법 (insulin reduction assay)를 통하여 순수 분리된 단백질의 활성을 알아보았다. AtTrx-h3와 Positive control로 사용한 E.coli thioredoxin (EcTrx)은 낮은 농도 (3 μM)에서 효과적으로 인슐린을 환원 시킬 수 있었으나, 고 농도 (50 μM)에서는 EcTrx의 인슐린 환원 활성이 농도 의존적으로 증가하는 것과는 달리 AtTrx-h3는 농도 의존적으로 인슐린 환원 활성이 감소하는 것을 보고 전형적인 분자 샤페론의 특징을 가지는 것을 알 수 있었다. AtTrx-h3의 분자 샤페론의 역할을 규명하기 위하여 말레이트 디하이드로제나아제 (malate dehydregenase; MDH)를 사용하여 두 가지 샤페론 활성 중 하나인 holdase 활성을 측정한 결과 대조구로 사용한 EcTrx는 MDH와 농도 비율이 10:1 일 경우에도 열에 의한 MDH의 변성을 방지하지 못했지만 AtTrx-h3는 MDH와의 농도 비율이 3:1, 6:1로 농도가 증가함에 따라 열에 의한 MDH의 변성을 방지할 수 있음을 통해 AtTrx-h3는 세포 내에서 샤페론 기능을 수행 함을 알 수 있었다. 샤페론의 또 다른 활성인 foldase 활성을 측정한 결과 낮은 농도 (5 μM)에서 AtTrx-h3의 foldase 활성은 EcTrx의 foldase 활성 보다 낮았지만 화학물질에 의한 MDH의 변성을 효과적으로 refolding 함으로서 foldase 활성을 보였다. 하지만 고농도로 단백질 양이 증가함에 따라 EcTrx는 foldase 활성이 점차 증가하는 것과는 반대로 AtTrx-h3는 농도가 증가함에 따라서 foldsae 활성이 줄어들고 50 μM에서는 전혀 foldase 활성이 없었다. 또한, AtTrx-h3는 변성된 MDH의 refolding 반응에서 DTT를 첨가하지 않았을 경우에도 전혀 foldase 활성이 나타나지 않았다. 결과적으로 AtTrx-h3는 reductase 활성, 샤페론의 holdase와 foldase 활성 등, 세가지 기능을 수행할 수 있는 단백질임을 확인하였다. EcTrx와 AtTrx-h3의 활성차이를 4 차원적인 구조분석을 통해 분석하기 위해서 size exclusion chromatography (SEC)를 수행한 결과 EcTrx가 단일 형태의 단백질 구조를 가지는 것과는 달리 AtTrx-h3는 다양한 복합체를 형성한다는 사실을 발견하였으며 이는 native-PAGE도 확인하였다. 다양한 형태의 AtTrx-h3 구조의 분자량을 측정하기 위해 SEC에서 고분자 단백질 분획과 저 분자 분획을 equilibrium sedimentation 분석을 수행한 결과, 고분자 단백질 복합체 분획은 약 128 mer (MW = 1,664 kDa) 였으며 저 분자 단백질 분획은 monomer (MW = 13 kDa) 구조라는 것을 알 수 있었다. 또한 단백질 구조와 활성의 관계를 규명하기 위하여 SEC로 분획된 AtTrx-h3를 F-I, F-II, F-III 세 개의 분획에 대한 holdase, foldase, reductase의 활성을 측정한 결과 holdase 활성은 고분자 단백질 복합체 분획 (F-I, F-II)에서 나타났고, foldase와 reductase 활성은 저분자 분자 단백질 분획 (F-III)에서 나타났다. 활성의 시스테인 (C)을 세린 (S)으로 치환 시킨AtTrx-h3를 SEC으로 분획한 결과, 고분자 단백질 복합체 형성은 산화-환원 비의존적으로 형성이 되었다. 스테인 39과 42를 세린으로 각각 치환한 C39S와 C42S, 시스테인 39와 42를 모두 세린으로 치환한 C39/42S mutant 단백질들의 holdase, foldase, reductase 활성을 측정한 결과, 시스테인 mutant 단백질들의 holdase 활성은 산화-환원 비의존적으로 대조구에 비해서 비슷한 활성을 보였으나 reductase 활성과 foldase 활성은 전혀 나타나지 않았다. 이러한 결과로, AtTrx-h3의 시스테인 잔기는 holdase에는 영향이 없지만 foldase, reductase 활성에는 산화-환원 의존적으로 영향을 주는 것을 확인하였다. 야생형 아라비돕시스를 42℃ 에서 열처리를 시간 별로 한 다음 AtTrx-h3의 구조변화를 Western blot으로 확인해 본 결과, 열 처리 시간이 길어짐에 따라 저분자 단백질에서 고분자 단백질 복합체으로 구조가 변하는 것을 확인하였으며, 열 처리 후 22℃ 회복시간 (recovery time)을 6 시간과 12 시간을 주었을 때 다시 고분자 단백질 복합체에서 저분자 단백질로 구조가 변화됨을 확인할 수 있었다. 이로서 AtTrx-h3의 구조는 열 충격에 의해서 단백질 구조가 가역적으로 조절되는 것을 알 수 있었다. AtTrx-h3와 시스테인 double mutant (DM) 그리고 vector를 과발현 (over-expression)하는 형질전환 식물체와 AtTrx-h3의 발현을 감소시킨 (RNAi) 형질전환 식물체를 제조한 후 야생형과 함께 37℃ 에서 5 일간 열처리한 다음 22℃ 에서 6 일간 회복시간 (recovery time)을 주었을때 AtTrx-h3와 시스테인 double mutant가 과발현된 형질전환 식물체가 야생형과 AtTrx-h3가 suppression된 형질전환 식물체보다 열에 대한 저항성이 강화 된다는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과들로 AtTrx-h3의 holdase 기능이 식물체의 열 저항성을 부여한다는 사실을 확인할 수 있었다.
목차moremore
Ⅰ.INTRODUCTION = 1
Ⅱ.MATERIALS AND METHODS = 30
1. Materials = 30
...
Ⅰ.INTRODUCTION = 1
Ⅱ.MATERIALS AND METHODS = 30
1. Materials = 30
2.Isolation of heat-stable proteins from Arabidopsis suspension cells = 30
3.Two-dimensional gel electrophoresis = 31
4.In-gel digestion and MALDI-TOF (matrix-assisted laser desorption/ionization-time-of-flight) = 31
5.Cloning and mutation of AtTrx-h3 gene and expression of the protein in E. coli = 32
6.Activity assay of insulin reductase = 33
7.Activity assay of foldase chaperone = 34
8.Activity assay of holdase chaperone = 34
9.Size exclusion chromatography (SEC) = 34
10.SDS-, native-PAGE and immuno blot analysis = 35
11.Measurement of bis-ANS fluorescence = 35
12. Equilibrium sedimentation analysis = 36
13.Heat-shock resistance of transgenic Arabidopsis over-expressing the AtTrx-h3 = 36
Ⅲ.RESULTS = 38
1.Isolation of heat-shock resistant proteins from Arabidopsis
suspension cells = 38
2.Expression and purification of AtTrx-h3 from Arabidopsis
suspension cells = 38
3.Concentration-dependent activity switching of AtTrx-h3 from foldase to a holdase chaperone = 38
4.Multiple structures of AtTrx-h3 = 49
5.Active Cys residues of AtTrx-h3 are prerequisite for representing its foldase chaperone = 55
6.Transgenic Arabidopsis over-expressing the AtTrx-h3 show an enhanced resistance against heat-shock stress = 58
Ⅳ.DISCUSSION = 67
Ⅴ.REFERENCES = 73